Солнце — энергия — жизнь

А. А. Кондрашин, кандидат биологических наук
В. Д. Самуилов, доктор биологических наук

В сб.: Биология наших дней. "Знание", стр. 5-29. М., 1982
В великом долгу все живое перед "хлорофилловым зерном". Именно здесь заканчивается космическое путешествие кванта солнечного света и начинается пора земных его похождений, сложных превращений его энергии. Результат этих превращений - жизнь. Очевидная аксиома: жизнь не может существовать и развиваться без поступления энергии извне. Сейчас уже можно описать основные принципы способа, с помощью которого живое обеспечивает себя энергией. Все, что нужно для этого: поймать и обуздать непоседливый квант солнечного света, направить его энергию на биосинтез органических соединений. И, если необходимо, окислить эти соединения, добыть запасенную в них химическую энергию и направить ее по назначению. На самом деле, способ только теперь кажется прост, и легко забыть, что почти два века понадобилось человечеству для понимания этой простоты.
Еще в конце XVIII в. Пристли, первооткрыватель кислорода, сам того не ведая, встал у порога биоэнергетической науки, науки об энергии жизни. В своих экспериментах он показал, что выделяют кислород растения, а потребляют животные. Чуть-чуть позже благодаря Лавуазье становится ясным, что животные поглощают кислород одновременно с "сжиганием" пищи. Теперь-то мы знаем, что выделение кислорода растениями - результат их фотосинтетической деятельности, а поглощение его животными - тканевое дыхание, окисление питательных веществ. А все вместе взятое - энергетический цикл в живой природе. Именно он определил полную зависимость животных от растений: чтобы жить, животные должны переварить массу "зеленой пищи". А образуется эта масса в процессе фотосинтеза, сущность которого заключается в улавливании энергии квантов солнечного света и использовании ее для образования органических Веществ из углекислого газа и воды. Тот кислород, который выделяют растения - водного происхождения, он получается при разложении воды под действием света. За год растения суши и океана манипулируют колоссальными количествами вещества и энергии: они усваивают 1,5x1011 т углекислого газа, разлагают 1,2x1011 т воды, выделяют 1011 т кислорода и запасают 6x1020 калорий энергии Солнца в виде химической энергии продуктов фотосинтеза. И без любого из этих продуктов немыслима жизнь. Вот почему в долгу живое перед хлорофиллом, своеобразными воротами, через которые энергия Солнца входит в мир живых клеток. Интерес к исследованиям механизма фотосинтеза всегда огромен. Слишком важное место занимает он в жизни, слишком большие надежды связывают ученые с его пониманием. И что привлекает в механизме фотосинтеза прежде всего? Конечно же, высочайшая эффективность преобразования солнечной энергии, не имеющая никаких аналогов в современной технике. Энергетический кризис... Попробуйте отыскать газету, не содержащую материалов " на эту злободневную для нас тему! Тон их пессимистичен, прогнозы вселяют тревогу. Действительно, топливные ресурсы Земли истощаются с возрастающей скоростью. А что же дальше? Укрощенная энергия термоядерных реакций? Отчасти - да. И успехи в этом направлении обязательно будут. А что еще? Не энергия ли Солнца? Ведь как ни странно, мы до сих пор почти не умеем использовать то, что оно щедро дарит нам каждый день и в огромных количествах. Пора исправить это досадное упущение. И сейчас нет сомнений в том, что использование принципов функционирования аппарата фотосинтеза, если они будут разгаданы, позволит решить эту проблему. Вот почему главное внимание исследователей фотосинтеза - к механизму преобразования энергии солнечного света. Вот почему в область фотосинтеза внедряются биоэнергетики, специальность которых - изучение механизмов трансформации энергии.
Многообразен мир фотосинтезирующих организмов. Разнообразны виды растений и водорослей. Причудливы формы жизни бактерий - эволюционных предков растений. Незначителен удельный вес бактерий в фотосинтетической продукции, но интерес к ним велик. И прежде всего благодаря относительной простоте устройства фотосинтезирующего. аппарата. Зеленые и пурпурные бактерии (названные так за их окраску) не расщепляют воду, как это делают растения, не выделяют кислород и поэтому лишены целого ряда ферментов, занимающихся этим нелегким делом. Вместе с тем принципы преобразования световой энергии в химическую энергию органических соединений у бактерий, водорослей и растений, по-видимому, существенно не различаются. Все это дает надежду на более полное описание механизма действия фотосинтезирующего аппарата прежде всего у бактерий. Логика поиска: от простого к сложному. Попробуем ограничить себя и рассказать в основном о механизме бактериального фотосинтеза.

Аппарат укрощения

Вы, вероятно, заметили, что логичный, в общем-то, для ученых принцип энергообеспечения, о котором мы уже упоминали, может показаться не совсем логичным для непосвященных. В самом деле, стоило ли монтировать громоздкую систему преобразования энергии солнечного счета в энергию химических связей органических соединений? Ведь, как известно, для того чтобы обеспечить себя энергией, живые организмы все равно будут вынуждены расщепить их, извлечь их энергию и направить ее для получения аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) - универсального энергетического донора биохимических реакций. А нельзя ли использовать солнечные кванты непосредственно, внедрить их энергию прямо в биохимические процессы? Увы, нет! И виной тому, прежде всего, мимолетность жизни кванта солнечного света. Он жив, пока светит Солнце. А жизнь клеток не может останавливаться на заходе Солнца и возрождаться вместе с восходом. Энергия нужна клеткам постоянно. Непостоянную энергию солнечного кванта необходимо стабилизировать. Нужен аппарат укрощения его энергии.
И, конечно, он существует. Все процессы преобразования энергии солнечного света происходят в специализированных мембранных структурах - в хлоропластах у растений и в хроматофорах у бактерий - энергопреобразующих органеллах фотосинтезирующих организмов. А начинаются эти процессы, как мы уже знаем, в молекуле особого пигмента - хлорофилла. В хлоропластах и бактериальных хроматофорах содержатся две фракции хлорофилла, различающиеся по своим свойствам. Больше всего хлорофилла (98% или более от его общего количества) занимается светосбором. Это так называемая хлорофильная молекулярная антенна. Название необычное, но весьма точное. Равномерно распределенный в мембране органелл, хлорофилл молекулярной антенны, как это следует из его названия, настроен на прием квантов солнечного света. Попав в молекулу хлорофилла, кванты "заряжают" некоторые электроны хлорофилла своей энергией, которые мгновенно переходят на новый, более высокий энергетический уровень. Такие "возбужденные" электроны, вполне естественно, стремятся избавиться от избытка энергии и перейти в свое прежнее, более устойчивое энергетическое состояние. И вот здесь-то раскрывается другая функция молекулярной антенны: передача энергии молекулам другой, меньшей фракции хлорофилла - молекулам хлорофильных реакционных центров.
Выделение хлорофильных реакционных центров бактерий в чистом виде, проведенное сравнительно недавно, несомненно, одно из крупных достижений в исследовании структуры и функций фотосинтезирующего аппарата. И достигнут этот успех был благодаря использованию поверхностно-активных веществ - детергентов, способных внедряться в толщу белковофосфолипидных мембран энергопреобразующих органелл и извлекать из них хлорофилл-белковые комплексы. Мембраны отдают в раствор свои компоненты, а дальнейшее выделение чистых ферментов - дело биохимической технологии. Биохимическими методами отдельно получены и комплексы реакционных центров, и комплексы светсобирающей антенны. Появилась возможность подробно изучить состав реакционных центров - того самого святилища, в котором совершаются первичные процессы аккумуляции энергии Солнца.
Оказалось, что в состав реакционных центров входит белок, состоящий из трех частей - субъединиц, четыре молекулы бактериохлорофилла, две молекулы другого пигмента - бактериофеофитина, одна-две молекулы специального переносчика зарядов - убихинона и один атом железа. Такой комплекс и преобразует дальше энергию "возбужденных" электронов.
Примерно 50 молекул антенны передают свою энергию на одну молекулу реакционного центра. В этой молекуле как бы фокусируется энергия, полученная от десятков молекул антенны. И результат такого обилия энергии неизбежен: включается реакция разделения зарядов. Бактериохлорофилл отдает свой богатый энергией электрон через бактериофеофитин на первичный акцептор "возбужденных" электронов, которым, по-видимому, является комплекс железа и убихинона. Так разделяются заряды: бактериохлорофилл теряет электрон - заряжается положительно, а первичный акцептор его получает, он приобретает отрицательный заряд. Трудно представить себе времена, за которые происходит эта реакция - примерно 10-10 с.
Но это только начало. Стабилизация энергии еще не произошла. Электрон готов в любое время вернуться в исходное состояние. И, конечно, его энергия была бы потеряна безвозвратно. Так происходит в пробирке с выделенным хлорофиллом, очищенным от других компонентов, которые принимают участие в дальнейшей судьбе "возбужденного" электрона. Хлорофилл в пробирке светится и его флуоресценция не что иное, как самопроизвольное испускание энергии в той форме, в которой она была получена - в виде света.
И чтобы этого не произошло, действует комплекс окислительно-восстановительных ферментов, которых лишен очищенный хлорофилл. В неповрежденных мембранах фотосинтезирующих органелл реакционные центры упакованы в тесном взаимодействии с комплексом окислительно-восстановительных ферментов - фотосинтетической цепью переноса электронов. Это убихинон, цитохромы - белки, содержащие железо, соединенные между собой последовательно, перехватывающие электрон у первичного акцептора и передающие его друг другу. В процессе такой эстафетной передачи богатый энергией электрон также теряет свою энергию, но теперь он это делает постепенно, небольшими порциями, которые, в свою очередь, используются на синтез АТФ. Выжав из электрона избыточную энергию, цитохромы возвращают его на прежнее место в молекулу бактериохлорофилла. Он вновь готов принять очередную порцию энергии.
Очевидно, в этой общей схеме кроется немало различных загадок, но самая важная из них, несомненно, загадка трансформации энергии, которая выделяется при переносе электронов по фотосинтетической цепи, в энергию химических связей АТФ. Именно этот процесс и является основным в деле запасания и стабилизации солнечной энергии. Природа избрала АТФ на роль своеобразной энергетической валюты, которой оплачивается практически любая функция в живом организме, нуждающаяся в энергии. Центральное место АТФ в энергетике клетки определяется тем, что именно на использование ее энергии настроены в ходе эволюции биохимические процессы. И в этом проявляется еще одна из многих мудростей живого - образование унифицированной формы энергии, такой ее формы, которая могла бы быть использована в самых разных процессах.
Уникальные свойства АТФ не являются чем-то мистическим. Способность аккумулировать энергию определяется природой ее химических связей, своеобразием их электронных взаимодействий. В этой молекуле связаны воедино пять компонентов: два из них органического происхождения - аденин и сахар, рибоза и три - неорганического, остатки фосфорной кислоты. При синтезе АТФ, так называемом фосфорилировании, к молекуле аденозиндифосфорной кислоты (АДФ), содержащей два остатка фосфорной кислоты, присоединяется третий остаток. Этот остаток невозможно присоединить, не затратив энергии, которая трансформируется в энергию связи между двумя остатками и "заряжает" электроны, образующие эту связь. Гидролиз АТФ, разрыв ее высокоэнергетической связи сопровождается выделением той энергии, которая была затрачена на ее образование. Если гидролизовать АТФ в пробирке - энергия рассеется в виде тепла. В клетке энергия передается совместно с остатком фосфорной кислоты, который присоединяется к молекуле какого-либо фермента, катализирующего биохитгеческую реакцию, и активирует ее своей энергией.
Сразу заметим, что и на молекуле АТФ стабилизация энергии солнечного света не закончилась. АТФ можно назвать лишь относительно стабильным соединением. Со временем оно самопроизвольно гидролизуется и теряет свою энергию. Как же решается это противоречие? Энергия АТФ направляется на биосинтез глюкозы. И вот адесь-то энергия электронов, возбужденных солнечным цветом, стабилизируется окончательно. Сахар (это мы знаем из повседневной жизни) можно хранить сколько угодно и использовать по мере необходимости. Это и делает живая природа. Постепенно расходуя свои запасы углеводов, она окисляет их и извлекает энергию, заключенную в химических связях. Энергия глюкозы не могла бы быть реализована полностью без участия митохондрий - энергопреобразующих органелл животных и растений. Митохондрии - своеобразные антиподы хлоропластов. Если последние используют АТФ на синтез стабильных органических веществ, то митохондрии, напротив, используют органические вещества, продукты расщепления белков, жиров и углеводов, чтобы получить АТФ. В противоположность фотосинтетическому фосфорилированию, которое происходит при .фотосинтезе, реакция образования АТФ в митохондриях названа окислительным фосфорилированием. В этом определении - сущность процесса, так как синтез АТФ ,в митохондриях происходит сопряженно с окислением органических питательных веществ дыхательной цепью. Длительная цепь, ряд соединенных последовательно окислительно-восстановительных ферментов (цитохромов и других компонентов), захватывает богатые энергией электроны окисляемых веществ, с тем чтобы совсем так, как; в фотосинтетической цепи, постепенно лишить их энергии я направить ее на синтез АТФ. Обедненные энергией электроны соединяются с кислородом в реакции образования воды.
При окислении питательных веществ в митохондрии поребляется кислород, а выделяются углекислый газ и вода, которые используются на фотосинтез глюкозы. Так замыкается круговорот веществ в живой природе, неразрывно связанный с энергетическим циклом.
Таким образом, решение проблемы преобразования солнечной энергии - это, прежде всего, решение вопроса о том, каким образом энергия богатых энергией электронов трансформируется в энергию химических связей АТФ,- основного вопроса биоэнергетики.

Трансформация... трансформаторов

Когда в 1966 г. Владимир Петрович Скулачев, заведующий отделом биоэнергетики, ныне член-корреспондент АН СССР, рассказывал о ситуации, сложившейся к тому времени в области окислительного и фотосинтетического фосфорилирования, он нарисовал странный на первый взгляд график, но который, как оказалось, превосходно ее иллюстрировал. По одной оси им были отложены годы, а по другой... отношение оптимистов в биоэнергетике к пессимистам. Оптимисты упорно верили в возможность ближайшего решения проблемы, пессимисты - нет. Тогда, в 1966 году, график стремительно мчался вниз, отражая собой крайний пессимизм, охвативший большинство исследователей. Казалось, что надежды повернуть упрямую кривую вверх полностью исчерпаны.
Чрезвычайно популярная среди биохимиков в то время "химическая" гипотеза фосфорилирования, сопряженного с переносом электронов, не могла этого сделать. Более того, она постоянно разочаровывала, не в силах справиться с объяснением экспериментальных фактов. Сторонники "химической" схемы энергетического сопряжения полагали, что энергия, выделяющаяся при переносе электронов, переходит в молекулу АТФ при посредничестве промежуточных высокоэнергетических соединений. Решить проблему, по их мнению, означало найти и охарактеризовать эти соединения. Шли годы, а соединения, обозначенные на схеме символами неизвестных, оставались неразгаданными. И мыслимое ли дело поймать какого-либо из этих неизвестных прямо на месте преступления", в момент передачи ими энергии на синтез АТФ, если предварительно постулируется их высокая лабильность? Безнадежное дело! Настоящая охота, которую развернули на "икс" биоэнергетики, окончилась провалом. И хотя поискам сопутствовали часто очень интересные, важные наблюдения, много сил и времени было потрачено впустую. Неудача, к сожалению, не сломила инертность мысля. По аналогии с прежней схемой к объяснению результатов привлекались новые символы. Когда же возникла опасность, что для обозначения неизвестных высокоэнергетических соединений не хватит букв латинского алфавита, традиционно использовавшихся для их обозначения, наступило всеобщее разочарование. На графике этому моменту соответствовал глубокий минимум.
А в это время на юго-западе Англии, в маленькой лаборатории, созданной на собственные средства, колдовал над митохондрией Питер Митчелл. Он не мог двинуть в поход за тайной фосфорилирования утонченную современную технику и тщательно изучал данные, полученные с помощью заурядного рН-метра, прибора, настроенного на измерение концентрации ионов водорода. Этот прибор, далеко не чудо измерительной техники, является неизменным атрибутом любой биохимической лаборатории. Состоялось очередное подтверждение старой истины: техника, сколь совершенной она бы ни была, сама по себе в науке бессильна; оригинальность мысли, умение обратить внимание на факты, мимо которых прошли многие,- вот ее истинный двигатель.
К 1966 г. Митчеллом были опубликованы первые свидетельства в пользу своей гипотезы, о которой он впервые заявил еще в 1961 г. Тогда она прошла практически незамеченной. С одной стороны - привычка оперировать знакомыми схемами, с другой - законная осторожность, вызванная необычайной плодовитостью биоэнергетиков того времени на гипотезы энергетического сопряжения.
В 1966 г. на съезде Федерации европейских биохимических обществ состоялось и первое публичное обсуждение предположений Митчелла в кругу ведущих специалистов... и они были отвергнуты. И кто из самых яростных оппонентов Митчелла мог тогда предположить, что всего лишь через 12 лет автор этих, как их назвали, "фантастических" предположений будет удостоен Нобелевской премии, выдающегося признания его заслуг! Идеи Митчелла отпугивали своей сложностью и новизной подхода, но, надо признать, и значительно привлекали. И прежде всего многообразнейшими возможностями их проверки. В соответствии со взглядами Митчелла фотосинтети ческая цепь переноса электронов в хлоропластах и хроматофорах или дыхательная цепь в митохондриях особым образом перешнуровывает мембрану этих органелл, петляя от одной ее поверхности к другой. Перенос электронов по цепям ферментов, ориентированных таким способом, сопровождается транспортом положительно заряженных ионов водорода-протонов через мембрану, что неизбежно приводит к возникновению разности электрических потенциалов по две ее стороны. Таким образом, цепи переноса электронов в мембранах работают как генераторы электрического тока. Более того, по Митчеллу, каждый отдельный олигоферментный комплекс, входящий в состав электронтранспортной цепи,- генератор электрического тока. Нетрудно заметить, что этот процесс не мог бы реализоваться вне мембраны. Мембрана у Митчелла одно из главных действующих лиц в процессе сопряжения. Очевидно, что она должна выполнять функцию изолятора, разделяющего две группы зарядов: отрицательных, с одной стороны, и положительных - с другой. Для того чтобы удержать возникший мембранный потенциал, необходимо ее высокое электрическое сопротивление. Совсем как в конденсаторе, где малейшее нарушение изоляции приводит к пробою, к разряду электрического тока. Любопытно, но до Митчелла роль мембраны в энергетическом сопряжении практически не учитывалась. То, что эти процессы протекают в мембране, воспринималось скорее как случайность, а не неизбежность. С другой стороны, не придавалось большого значения и высокой упорядоченности мембран, трансформирующих энергию, тому порядку, с которым уложены в мембране молекулы ферментов и фосфолипидов.
Указания на то, что комплексы ферментов, преобразующих энергию, располагаются в мембране не беспорядочно, были получены и раньше. К примеру, было ясно, что молекулы хлорофилла в хлоропластах расположены в особых упорядоченных структурах, гранах, которые соединяются между собой и образуют своеобразные стопки, наподобие пластинок в электрической батарее. В этом исследователи видели, и вполне справедливо, одну из причин высокой эффективности фотосинтеза, закономерного и последовательного характера его процессов.
Необходимость упорядоченной структуры сопрягающих мембран - тех, в которых локализованы трансформаторы энергии, становится еще более очевидной с точки зрения Митчелла. Образование мембранного потенциала оказалось бы невозможным без особой организации ферментов цепей переноса электронов внутри мембраны, которая бы обеспечила векторный транспорт электрических зарядов через мембрану. И как следствие этого - асимметричность мембраны, ее анизотропия. Отсюда становится ясным, почему отдельные составные компоненты полиферментных комплексов, к каким относятся и цепи переноса электронов, должны располагаться на одной поверхности мембраны, а другие - на другой. Очевидно, что только в этом случае произойдет разделение зарядов в масштабе мембраны при протекании окислительно-восстановительной реакции между двумя отдельными ферментами. Образование разности электрических потенциалов на мембране и определяет, по Митчеллу, все последующие события: синтез АТФ, транспорт ионов и многое, многое другое. Особенно легко решаются теперь проблемы транспорта веществ через мембрану, долгое время не поддававшиеся разрешению. Действительно, если есть электрическое поле на мембране, значит, есть и сила, способная привести в движение заряженные вещества - ионы. По принципу обычного электрофореза положительно заряженные ионы пойдут в область, заряженную отрицательно, а отрицательные - в противоположном направлении. Помимо трансмембранной разности электрических потенциалов, которая является следствием разделения электрических зарядов, при работе цепей переноса электронов, таким образом, должен возникать также и градиент ионов водорода, транспортируемых через мембрану. Ну,а если есть градиент ионов водорода, значит, имеется возможность переправить через мембрану и нейтральные молекулы, способные использовать энергию этого градиента.
А как же с АТФ? Каким образом можно решить проблему ее синтеза, если мембранный потенциал действительно существует? Митчелл считает, что именно энергия электрического потенциала является движущей силой ее синтеза. Достигнув определенной величины при работе цепей переноса электронов, электричество включает работу АТФсинтетазы, фермента, встроенного в ту же мембрану и настроенного на синтез АТФ из АДФ (аденозиндифосфорной кислоты) и неорганического фосфата.
Так становится очевидным, что постулируется существование промежуточного этапа преобразования энергии солнечного света или питательных веществ: энергия, каково бы ни было ее происхождение, сначала обязательно превращается в электрическую, а затем трансформируется в химическую, в энергию АТФ.
Нетрудно заметить, что неуловимый высокоэнергетический интермедиат электронтранспортного фосфорилирования, предмет давнего вожделения сторонников "химической" схемы, приобретает зримые очертания. Это не что иное, как то самое электричество, которое уже давно используется человеком в качестве посредника при любых превращениях энергии. И кто бы мог подумать, что в живой клетке унифицированная форма энергии тоже электрическая?
А почему бы и нет? Электрическая энергия, это мы хорошо знаем, обладает массой различных достоинств. Ее легко, при наличии, конечно, соответствующих трансформаторов, можно превратить в другие виды энергии - в тепловую, световую, химическую. Ее просто передавать на далекие расстояния. И почему бы клетке не воспользоваться этими достоинствами? И она, как это ясно теперь, не упустила эти возможности. Мимо достоинств электричества не прошел и Митчелл при обдумывании своей, как он назвал, "хемиосмотической" гипотезы энергетического сопряжения. За прошедшие годы гипотеза трансформировалась в теорию. Столь же существенную трансформацию претерпели за эти годы и наши представления о трансформаторах энергии в живой клетке. И вот как это произошло...

В поисках мембранного электричества

Даже при поверхностном знакомстве с идеями Митчелла ясными становятся шаги, которые можно было бы предпринять для их проверки. И, разумеется, прежде всего необходимо ответить, действительно ли энергия, выделяющаяся при переносе электронов, преобразуется в электрическую. Это не только центральный постулат Митчелла - доказательство существования электрического потенциала на мембранах энергопреобразующих органелл перевернуло бы наши представления о путях трансформации солнечной энергии и энергии питательных веществ в живых клетках, сдвинуло бы с мертвой точки решение проблемы о движущей силе ионов и продуктов обмена веществ через мембрану, что само по себе имеет немаловажное значение.
Но как это сделать? Обнаружение разности электрических потенциалов на биологических мембранах не является тривиальным делом. Немало трудностей преодолели исследователи, чтобы научиться измерять электрические сигналы при проведении возбуждения по нервному волокну с помощью микроэлектродов. Используя опыт такого рода измерений, микроэлектродную технику применили американские исследователи Тапер и Тедески для определения мембранного потенциала митохондрий - и потерпели неудачу. Потенциал, зарегистрированный ими, оказался равным лишь 20 мВ и был ориентирован в направлении, противоположном тому, которое предсказывал Митчелл. Приверженцы "химической" схемы торжествовали: гипотеза не оправдывалась в самом главном пункте. И, как ни парадоксально, с некоторым чувством удовлетворения восприняли эти результаты и сторонники английского ученого. Они предсказывали неудачу прямого микроэлектродного метода.
В самом деле, митохондрия - крошечное образование, ее диаметр редко превышает 3 мк. Не так-то просто ввести в митохондрию электрод, чей диаметр лишь в несколько раз меньше ее собственного. А если к тому же мембрана обладает свойствами, которыми ее наделил Митчелл, то введение электрода нанесло бы ей тяжелую травму: нарушение ее изоляционного слоя и как следствие утечка электрического заряда. Вот почему неудача микроэлектродного метода была воспринята скорее как подтверждение, а не как опровержение хемиосмотической гипотезы.
Большего успеха достигли исследователи на биологическом факультете МГУ под руководством Ф. Ф. Литвина и Г. А. Куреллы. В качестве объекта для микроэлектродного измерения мембранного потенциала ими были использованы относительно крупные хлоропласты, выделенные из специальных видов растений и обладающие диаметром до 25 мк. Введение электрода в такой хлоропласт оказалось менее "болезненным" для него, и он был способен проявлять исходные свойства. Так, было показано, что при освещении хлоропластов происходит быстрое образование разности электрических потенциалов на мембране. Одновременно стало очевидным, что возможности использования микроэлектродов в опытах с хроматофорами бактерий практически сводятся к нулю: средний диаметр хроматофоров равен 400-600 А - в десять раз меньше митохондриального.
В связи с непригодностью микроэлектродного метода пришлось сосредоточить усилия на исследовании процессов, хотя бы косвенно указывавших на образование мембранного потенциала. Это вполне возможно, если научиться следить за перемещением заряженных частиц в среде, где работают органеллы, выделенные из клетки. Логика ясна: если внутрь частиц пойдут положительно заряженные ионы, значит, внутри - минус, если отрицательные - плюс. И наоборот.
Именно такие эксперименты, поставленные Митчеллом, и дали первые свидетельства образования мембранного потенциала в митохондриях. Лабораторный рН-метр помог ему зарегистрировать появление в среде ионов водорода при работе дыхательной цепи.
Более корректный метод был разработан в нашей стране под руководством Е. А. Либермана и В. П. Скулачева. Электрическая схема митохондрий, хлоропластов и хроматофоров исследовалась с помощью синтетических ионов, различающихся по своей природе и знаку заряда, но сходных в одном: все они легко проникали через фосфолипидные мембраны. Это весьма важное свойство, которое позволяло им быть чуткими индикаторами изменений электрического поля на мембране.
В опытах с синтетическими ионами были получены изящные подтверждения основных положений гипотезы. При добавлении в среду инкубации митохондрий питательных веществ отрицательно заряженные ионы тотчас же выходили из частиц, что могло быть объяснено только давлением на них электрического поля со знаком "минус" на внутренней стороне мембраны. В хроматофорах ориентация потенциала оказалась обратной. При их освещении "минусы" входили в частицы, притягиваясь к внутреннему "плюсу". Так казавшееся вначале фантастическим предположение Митчелла обретало реальные очертания: перенос Электронов по цепям окислительно-восстановительных ферментов действительно сопровождался генерацией электрического тока в мембране. Энергопреобразующие органеллы, которые прежде называли электростанциями живой клетки лишь ради красного словца, желая подчеркнуть их исключительную роль в процессах энергообеспечения, ими оказались и на деле.
Как сказал однажды В. П. Скулачев, результат работы был приятен еще и потому, что затевалась она с целью опровергнуть идеи Митчелла, а не подтвердить. Ведь обилие гипотез, в одинаковой степени интересных, имеет и отрицательную сторону: отвлекает внимание и рассеивает силы. Путь к истине может стать короче, если решительно отвергнуть идеи, на первый взгляд привлекательные, но не выдерживающие многосторонней проверки. Так будет отточено острие поиска.
Гипотеза Митчелла крайне заманчива для опровержения - стоит только показать, что мембранного потенциала не существует, и ее изящное здание рухнет, как карточный, домик. Но этого не случилось и не могло случиться. На этот раз ученые решились опровергнуть реально существующее явление, а в результате доказали его. Так и должно быть, если позиция экспериментатора объективна и беспристрастна.
И все же, несмотря на довольно убедительные свидетельства существования на мембранах, преобразующих энергию, разности электрических потенциалов, недоверие к хемиосмотической гипотезе оставалось. Опыты с ионами, носили косвенный характер, а в силу чрезвычайной важности проблемы требовались прямые доказательства. И они были получены...

Проблемы и протеолипосомы

Мы уже почти привыкли к тому, что решение фундаментальных загадок природы не проходит без ломки многих привычных представлений, которые складывались десятилетиями. Так было в физике и химии, так на наших глазах происходит в биологии. К фундаментальным относится и тайна энергетического сопряжения, и гипотеза Митчелла - не исключение, а яркое подтверждение этого правила.
И еще одно заключение, которое ставит хемиосмотическую гипотезу в ряд с наиболее выдающимися,- ценность ее следствий. Как из любой плодотворной гипотезы, из гипотезы Митчелла вытекают следствия, имеющие не менее важное значение, чем ее основные постулаты. Следствия, способные к самостоятельной жизни.
К ним относится и предположение о существовании белковых генераторов электричества. Нетрудно видеть, что мысль об этом скрывается в главном митчелловом постулате - о мембранном потенциале. В самом деле, образование мембранного потенциала, если таковой существует, невозможно без участия белков ферментов, катализирующих перенос зарядов через мембрану, а значит, в живых клетках должны существовать белковые электростанции. Задача - найти их и доказать их функцию. И это много больше, чем простое подтверждение одного из предположений Митчелла,- это открытие особого класса белков, специальность которых - трансформировать химическую или световую энергию в электрическую форму. Игра стоит свеч!
Итак, определив цель исследований, неплохо бы определить и их предмет, представить, каковы же претенденты на эту роль? Ну, это уже не столь сложно. По-видимому, прежде всего, белковыми электростанциями должны быть любые из полиферментных комплексов, входящих в состав цепей переноса электронов и способных работать в автономном режиме. Цепь переноса электронов - не что иное, как электрическая батарея, элементы которой- отдельные полиферментные комплексы. А если так, то любой из элементов может быть отделен от других без потери электрогенных свойств. Да, но при этом нельзя забывать, что электрический потенциал, который образуют электронпереносящие цепи, - трансмембранный, а поэтому электрогенные свойства ферментов не могут реализоваться вне мембраны. Игнорирование мембран в энергетическом сопряжении, по-видимому, и было причиной неудачных попыток продемонстрировать синтез АТФ при работе изолированных ферментов дыхательной цепи митохондрий в растворе.
Стало очевидным: изолированный и очищенный от других компонентов мембранный белок необходимо вновь включить в мембрану. А далее все просто: если фермент - "один в поле воин", то включение реакции, которую он катализирует, приведет к генерации электрического потенциала. Да, но как это сделать? Ведь, по существу, придется каким-то образом повторить путь, пройденный природой, и собрать действующую мембрану из составляющих ее компонентов. Не будет ли этот путь слишком длинным? И можно ли избежать неминуемых на таком пути подводных камней? Как оказалось впоследствии, эти трудности преодолеть можно.
...Принцип метода, разработанного в лаборатории Э. Рэкера в США, прост и остроумен. Он позволил реконструировать исходную функцию изолированных ферментов дыхательной цепи митохондрий при их включении в искусственную мембранную систему. Для этого вначале из мембран митохондрий извлекался фермент, катализирующий какую-либо одну реакцию. Затем выделялись фосфолипиды, составляющие каркас мембраны, которые разбивались на мельчайшие частицы с помощью ультразвука и детергента. Полученные растворы фосфолипидов и фермента смешивали, а смесь помещали в мешочек из целлофана. Поры в целлофане были настолько малы, что не пропускали ни молекул фосфолипидов, ни молекул фермента. Если такой мешочек поместить в сосуд с раствором, то. в окружающий раствор уйдут только молекулы детергента, а фоефолипиды и белки останутся.
И вот оказалось, что при медленном удалении детергента фоефолипиды и белки самопроизвольно соединяются друг с другом, образуя миниатюрные мембранные пузырьки - протеолипосомы, способные катализировать соответствующие биохимические реакции. Добавив к раствору фосфолипидов фермент, замыкающий дыхательную цепь,- цитохромоксидазу и АТФсинтетазу из тех же митохондрий, в лаборатории Рэкера получили протеолипосомы, мембраны которых содержали и цитохромоксидазу и АТФсинтетазу. Такие протеолипосомы синтезировали АТФ при работе цитохромоксидазы.
Максимальное упрощение аппарата сопряжения, которое было достигнуто в этом опыте, позволило получить информацию о его работе, недоступную в случае целой, илцфкак говорят биохимики, интактной, митохондрии. Все бы хорошо, но о мембранном потенциале вновь получены лишь косвенные данные.
Использовав метод проникающих ионов, образование мембранного потенциала в таких протеолипосомах зарегистрировали в лаборатории В. П. Скулачева. Это был серьезный шаг вперед, который дал надежду на использование протеолипосом при изучении белковых преобразователей энергии. Итак, модель найдена, и довольно удачная, но метод измерения потенциала по-прежнему неудовлетворителен. На повестке дня - старая, нерешенная проблема, проблема прямых вольтметрических измерений мембранного электричества, так как только они могут дать неопровержимые доказательства причастности белков к "электрическому делу".
И, кажется, ясна основополагающая идея такого рода измерений: создание мембранной системы, которая включала бы в себя белковые комплексы и к которой можно было бы подобраться с помощью макроэлектродов. Неудачи с микроэлектродами слишком памятны. Белки необходимо включить в плоскую фосфолипидную мембрану. Электрические характеристики такой мембраны можно измерить макроэлектродами, расположенными по разные ее стороны.
Ну что же? Техника создания искусственных фосфолипидных мембран на небольших отверстиях в тефлоновых пластинках уже отработана. Плоская мембранка закрывает отверстие всякий раз, когда к нему подносят каплю фосфолипидов, растворенных в органике. Если тефлоновая пластинка с такой мембраной разделяет сосуд с электролитом на два отсека и в эти отсеки опускается по электроду, то готова система, с помощью которой можно исследовать электрические свойства искусственной мембраны. Проблема заключается в том, чтобы инкрустировать мембрану белком и при этом сохранить его исходные свойства.
И вот здесь скрывался корень зла. Несмотря на общую ясность подхода, решение ускользало. Белки не желали работать в такой системе. Более 20 лет пытался встроить белки в плоскую мембрану мексиканский ученый Монтал, многие годы безуспешно проработал в том же направлении американский исследователь Тиен. Неудачи следовали за неудачами. Чувствовалось, что упускается что-то крайне важное, что-то, без чего решение невозможно. Чувствовалось, не хватает оригинальной свежей идеи.

Белковые генераторы электричества

...Надежда на успех пришла неожиданно. В 1973 г. все с интересом слушали об удивительном открытии американца В. Стокениуса, с которым В. П. Скулачев познакомился в США на одной из конференций по биоэнергетике. В. Стокениус описал необычный белок из мембран фиолетовых бактерий, обитающих в просоленных, неуютных Калифорнийских пустынь. Названный бактеином, этот белок был очень красив. Почти пурпурный определял окраску не только бактерий, но и озер, давших им приют. Он относительно прост по строению и тем не менее загадочен, поскольку ретиналь, входящий в его состав, придает ему сходство со зрительным тарентом наших глаз - родопсином, ответственным за восприятие световых сигналов.
Этот белок - находка, тем более странная, поскольку система, необходимая для дальнейшего преобразования солнечной энергии у фиолетовых бактерий, начисто отсутствует. Это тем более странно, поскольку энергетика этих бактерий вполне обеспечена за счет дыхания. Что за бессмыслица - поглощать свет и не уметь его использовать? А ведь в природе, кажется, все целесообразно. А что, если этот белок необходим в каких-либо экстремальных условиях, например, в условиях кислородного голодания? Ведь в этом случае энергия солнечного света оказалась бы весьма кстати. Эта мысль и побудила Стокениуса заняться бактериородопсином со всей серьезностью.
Первая важная информация о функции бактериородопсина была получена с помощью все того же лабораторного рН-метра, так прекрасно зарекомендовавшего себя. На глазах у Стокениуса рН-метр зарегистрировал таинственные колебания концентрации ионов водорода в среде инкубации фиолетовых бактерий: при освещении клеток количество ионов водорода в среде увеличивалось, а л темноте уменьшалось. Увеличение концентрации ионов водорода в среде могло произойти лишь в результате фотохимической активности бактериородопсина, переносящего протоны через мембрану под действием света. А раз это так, то бактериородопсин - не что иное, как еще один трансформатор солнечной энергии.
С этих позиций становится понятным смысл корреляции баоевнтеза этого белка у бактерий с периодом их интенсивного накопления. Рост биомассы и как следствие быстрое истощение кислорода в среде обитания включает биосинтетические реакции, конечный продукт которых - бактериородопсин. Энергетика бактериальных клеток перестраивается: они становятся фотосинтезирующими и вместо химической энергии питательных веществ начинают использовать солнечную энергию.
Участие бактериородопсина в энергетическом сопряжении изящно продемонстрировали Рэкер и Стокениус. В одних протеолипосомах они объединили, кажется, несовместимое: бактериородопсин бактерий, АТФсинтетазу митохондрий и фосфолнпиды растений. И тем не менее образовался дружный ансамбль, способный синтезировать АТФ при включении света. С точки зрения сторонников "химического сопряжения", комбинация немыслимая, но вполне возможная с точки зрения сторонников хемиосмотических представлений, согласно которым синтез АТФ запускается электричеством, каково бы ни было его происхождение. Это и подтвердилось в эксперименте. Так что же: бактериородопсин - еще один белковый генератор электрического тока?
Да! И это утверждение было сделано в лаборатории В. П. Скулачева. Через мембраны протеолипосом, содержащих в качестве белкового компонента бактериородопсин, при включении света транспортировались синтетические ионы, что указывало на образование разности электрических потенциалов. Решающий же аргумент был получен тогда, когда бактериородопсиновые протеолипосомы удалось присоединить к плоской фосфолипидной мембране, разделяющей два отсека с погруженными в них макроэлектродами.
Решение проблемы прямых вольтметрических измерений мембранного электричества оказалось неожиданно простым: плоская мембрана инкрустировалась белком протеолипосом, которые связывались с ней с помощью кальция или других катионов. Включение света - и перо самописца, соединенного с вольтметром, рисует кривую генерации разности электрических потенциалов на плоской мембране. Очередной щелчок выключателя - и потенциал, рассеиваясь, исчезает. Сомнений нет, бактериородопсин работает как генератор электрического тока.
Высокая стабильность бактериородопсина (он не теряет своей активности при нагревании до 100° и хранится в холодильнике месяцами - вот уж действительно "не боится ни жары и ни холода") давала надежду на его прямое встраивание в плоскую фосфолипидную мембрану без помощи протеолипосом. С ним можно манипулировать как угодно долго. И еще одно удобство работы с этим замечательным белком - свет в качестве источника энергии.
В самом деле, плоская искусственная мембрана - создание нежное и боится малейших колебаний окружающей среды. Добавление в среду веществ превращается в целую проблему. Мембрана безжалостно рвется, зачеркивая тем самым усилия многих часов работы. Свет - совсем другое дело. С ним можно экспериментировать без особого риска.
Совокупность всех этих достоинств и позволила Л. А. Драчеву и его сотрудникам в лаборатории В. П. Скулачева в относительно короткое время подобрать условия, при которых бактериородопсин непосредственно вкраивался в плоскую мембрану и работал как светозависимый генератор электрического тока.
Используя опыт работы с бактериородопсином, нам удалось разработать универсальный метод прямого измерения электрической активности индивидуальных ферментов, участвующих в трансформации энергии. Схема любого из таких экспериментов воспроизводит всю эволюцию войска метода и включает в себя выделение и очистку мембранных белков, которые подозреваются в "электрическом деле", создание протеолипосом для реконструкции их свойств и встраивание последних в искусственную фосфолипидную мембрану.
Так удалось показать, что кроме бактериородопсина молекулярными генераторами электричества являются цитохромоксидаза и трансгидрогеназа митохондрий. Генератором оказалась и АТФсинтетаза, если ее заставить работать в обратном режиме, не на синтез, а на гидролиз АТФ. Разлагая АТФ, АТФсинтетаза меняет направление трансформации энергии и преобразует химическую энергию АТФ в электрическую форму. Вместе с изменением направления реакции фермент меняет и свое название: теперь он становится АТФазой.
Необходимо отметить, что открытие функции бактериородопсина ознаменовало собой крушение одной, казалось бы, наиболее незыблемой догмы биологии. Догмы, в которой утверждалось уникальное место хлорофилла в процессах фотосинтеза. Теперь ясно, хлорофилл может быть заменен другим пигментом, способным трансформировать солнечную энергию в электрическую.
Доказательство того, что при фотосинтезе солнечный свет используется в первую очередь для образования разности электрических потенциалов на мембранах фотосннтетиков, было получено нами в опытах с реакционными центрами из хроматофоров фотосинтезирующих бактерий, которые, как вы помните, сопрягают процессы поглощения света и миграции энергии электронного возбуждения с переносом электронов по цепи окислительно-восстановительных ферментов.
Основываясь на опыте реконструкции митохондриальных систем, генерирующих мембранный потенциал, мы разработали метод сборки протеолипосом, содержащих изолированные комплексы реакционных центров. Такие протеолипосомы оказались красивыми не только внешне, по цвету напоминавшими расплавленный топаз. Красивыми оказались и их электрические ответы. Образование электрического потенциала мы регистрировали прямым методом, с помощью плоской мембраны, с которой протеолипосомы легко взаимодействовали в присутствии катионов. Мембранный потенциал возникал всякий раз, когда на плоскую мембрану, инкрустированную протеолипосомами, направлялся луч света.
Сомнений не было: комплексы хлорофильных реакционных центров - молекулярные генераторы электрического тока.
Величина потенциала резко возрастала, когда к протеолипосомам добавляли некоторое количество убихинона, который входит в комплекс первичного акцептора возбужденных светом электронов, и уменьшалась при добавлении ядов, выводящих из строя переносчики электронов или нарушающих изолирующие свойства мембраны. Система "протеолипосомы - плоская мембрана" оказалась отличной моделью для исследования интимных механизмов трансформации энергии. Максимальные электрические эффекты достигались в присутствии убихинона и одного из компонентов фотосинтетической цепи переноса электронов - цитохрома Ц, что свидетельствовало о полной реконструкции аппарата генерации мембранного потенциала в такой системе.
Удовлетворение было бы полным, если бы стали понятны причины странной ориентации электрического поля на мембране протеолипосом: она оказалась противоположной той, которая была отмечена ранее на мембране интактных хроматофоров. Внутренняя сторона мембраны протеолипосом заряжалась отрицательно, и это означало, что протоны, заряжающие мембрану, выделяются в окружающий раствор, а не во внутренний объем.
Закономерный вопрос: не потеряли ли мы при очистке препарата реакционных центров какой-то фактор, ответственный за их ориентацию в мембране? Метод реконструкции позволил ответить и на это. Вместо упрощения рукции бактериального "электрогенератора", к которому мы "стремились вначале, желая найти элементарную единицу, способную к генерации фототока, мы приступили к его постепенному усложнению. Для этого к комплексам реакционных центров при реконструкции протеолипосом мы добавляли возрастающие количества комплексов молекулярной антенны, выделенных из хроматофоров. Тех самых, которые собирают кванты солнечного света и поставляют их реакционным центрам. Это было удивительное зрелище, когда при определенном соотношении количества реакционных центров и антенны электрический ответ протеолипосом перевернулся и стал по своему направлению идентичным хроматофорному. Это было тем более удивительно, поскольку сами комплексы молекулярной антенны, реконструированные отдельно от реакционных центров, не обладали никакой фотоэлектрической активностью. Они только поглощали свет, но были неспособны его использовать.
Так стало очевидным, что ориентация электрического поля на мембране зависит от ориентации комплексов реакционных центров в ее толще. В свою очередь, реакционные центры ориентируются в мембране в зависимости от уровня структурной организации пигмент-белковых комплексов, которые используются при реконструкции. Такую организацию могут обеспечить лишь комплексы центров и антенны, взятые вместе и в определенной пропорции. Комплексы молекулярной антенны - вот тот таинственный фактор, который ориентирует реакционные центры при образовании мембран и заставляет их согласованно в одном направлении, что, без обязательно для генерации потенциала. Очевидно, что совмещение столь важных функций в одном белковом комплексе антенны имеет особый смысл: один комплекс ответствен и за восприятие солнечной энергии и за ее эффективное использование.
Как показали последующие эксперименты, белковыми генераторами электрического тока являются и компоненты системы преобразования энергии "возбужденных" электронов в хлоропластах растений. Протеолипосомы, нашпигованные зеленым хлорофиллом, выделенным из протертых листьев гороха М. Ильиной, при освещении давали фототок точно так же, как это происходило и в случае использования бактериального хлорофилла. Теперь совершенно ясно: весь смысл первичных преобразований солнечной энергии заключается в генерации электрического потенциала, энергия которого и используется впоследствии клеткой для решения своих энергетических проблем.

Заключение, которое может оказаться прологом

Итак, "ненаучная фантастика" о существовании молекулярных белковых генераторов электрического тока в живых клетках стала научной реальностью. Однако утверждение основных принципов хемиосмотической теории энергетического сопряжения не сняло с повестки дня вопрос о выяснении молекулярных механизмов трансформации энергии. Этот вопрос стал еще более актуальным, так как наметились реальные перспективы для его решения.
С новых позиций ведется сейчас конкретизация механизмов действия каждого отдельного преобразователя энергии. По словам В. П. Скулачева, именно в этом заключается в настоящее время задача биоэнергетической науки. Задача непростая. И, учитывая это, будущее, по-видимому, будет принадлежать исследователям, объединенным вместе для решения общей проблемы. Примеры такого плодотворного сотрудничества уже есть. В рамках организованного под руководством академика Ю. А. Овчинникова проекта "Родопсин" успешно выясняются детали устройства мощного генератора электрического тока, каким является бактериородопсин.
Важнейший прикладной аспект проблемы - применение полученных знаний для создания новых видов фотоэлектрических и топливных элементов, способных трансформировать энергию с высокой эффективностью. Недавние исследования, проведенные под руководством В. П. Скулачева в группе Л. А. Драчева, продемонстрировали возможности создания электрических элементов на основе белковых генераторов электрического тока. Было показано, что прекрасным генератором электричества является мембранный фильтр, пропитанный фосфолипидами и инкрустированный бактериородопсиновыми протеолипосомами или протеолипосомами, содержащими хлорофильные реакционные центры. Стабильность такой системы неизмеримо выше по сравнению с плоской мембраной, а надежность почти стопроцентная. В такой системе работают и другие трансформаторы энергии. Нет сомнений, что фильтры с белками-генераторами, включенными последовательно, могут составить прекрасную электрическую батарею. И это быстро поняли в самых различных лабораториях мира, если судить по количеству публикаций, в которых были воспроизведены полученные у нас результаты.
Исследования в области "модельной биоэнергетики" развернулись сейчас необычайно широко. Используя методы и идеи, предложенные в лаборатории В. П. Скулачева, бактериородопсиновую батарею собрал в Калифорнийском университете Л. Пэкер. Электрическая лампочка, подключенная к такой батарее, горела 90 минут при однократном использовании системы. Батарея сохраняла свои свойства в течение шести месяцев. Прогнозы на создание "белковых электростанций", преобразующих солнечную энергию, довольно оптимистичны. Здесь есть над чем подумать не только биоэнергетикам, но и инженерам. Вот почему наше заключение нам хочется назвать прологом...

Литература

"Солнце. Энергия. Жизнь" - читать интересную книгу автора (Кондрашин А.А.)

Солнце-энергия-жизнь
Библиотека сайта
История развития жизни
Креационизм
Ссылки
Hазад
Библиотека сайта
История развития жизни
Креационизм
Ссылки
Hазад

Солнце — энергия — жизнь

А. А. Кондрашин, кандидат биологических наук
В. Д. Самуилов, доктор биологических наук

В сб.: Биология наших дней. "Знание", стр. 5-29. М., 1982
В великом долгу все живое перед "хлорофилловым зерном". Именно здесь заканчивается космическое путешествие кванта солнечного света и начинается пора земных его похождений, сложных превращений его энергии. Результат этих превращений - жизнь. Очевидная аксиома: жизнь не может существовать и развиваться без поступления энергии извне. Сейчас уже можно описать основные принципы способа, с помощью которого живое обеспечивает себя энергией. Все, что нужно для этого: поймать и обуздать непоседливый квант солнечного света, направить его энергию на биосинтез органических соединений. И, если необходимо, окислить эти соединения, добыть запасенную в них химическую энергию и направить ее по назначению. На самом деле, способ только теперь кажется прост, и легко забыть, что почти два века понадобилось человечеству для понимания этой простоты.
Еще в конце XVIII в. Пристли, первооткрыватель кислорода, сам того не ведая, встал у порога биоэнергетической науки, науки об энергии жизни. В своих экспериментах он показал, что выделяют кислород растения, а потребляют животные. Чуть-чуть позже благодаря Лавуазье становится ясным, что животные поглощают кислород одновременно с "сжиганием" пищи. Теперь-то мы знаем, что выделение кислорода растениями - результат их фотосинтетической деятельности, а поглощение его животными - тканевое дыхание, окисление питательных веществ. А все вместе взятое - энергетический цикл в живой природе. Именно он определил полную зависимость животных от растений: чтобы жить, животные должны переварить массу "зеленой пищи". А образуется эта масса в процессе фотосинтеза, сущность которого заключается в улавливании энергии квантов солнечного света и использовании ее для образования органических Веществ из углекислого газа и воды. Тот кислород, который выделяют растения - водного происхождения, он получается при разложении воды под действием света. За год растения суши и океана манипулируют колоссальными количествами вещества и энергии: они усваивают 1,5x1011 т углекислого газа, разлагают 1,2x1011 т воды, выделяют 1011 т кислорода и запасают 6x1020 калорий энергии Солнца в виде химической энергии продуктов фотосинтеза. И без любого из этих продуктов немыслима жизнь. Вот почему в долгу живое перед хлорофиллом, своеобразными воротами, через которые энергия Солнца входит в мир живых клеток. Интерес к исследованиям механизма фотосинтеза всегда огромен. Слишком важное место занимает он в жизни, слишком большие надежды связывают ученые с его пониманием. И что привлекает в механизме фотосинтеза прежде всего? Конечно же, высочайшая эффективность преобразования солнечной энергии, не имеющая никаких аналогов в современной технике. Энергетический кризис... Попробуйте отыскать газету, не содержащую материалов " на эту злободневную для нас тему! Тон их пессимистичен, прогнозы вселяют тревогу. Действительно, топливные ресурсы Земли истощаются с возрастающей скоростью. А что же дальше? Укрощенная энергия термоядерных реакций? Отчасти - да. И успехи в этом направлении обязательно будут. А что еще? Не энергия ли Солнца? Ведь как ни странно, мы до сих пор почти не умеем использовать то, что оно щедро дарит нам каждый день и в огромных количествах. Пора исправить это досадное упущение. И сейчас нет сомнений в том, что использование принципов функционирования аппарата фотосинтеза, если они будут разгаданы, позволит решить эту проблему. Вот почему главное внимание исследователей фотосинтеза - к механизму преобразования энергии солнечного света. Вот почему в область фотосинтеза внедряются биоэнергетики, специальность которых - изучение механизмов трансформации энергии.
Многообразен мир фотосинтезирующих организмов. Разнообразны виды растений и водорослей. Причудливы формы жизни бактерий - эволюционных предков растений. Незначителен удельный вес бактерий в фотосинтетической продукции, но интерес к ним велик. И прежде всего благодаря относительной простоте устройства фотосинтезирующего. аппарата. Зеленые и пурпурные бактерии (названные так за их окраску) не расщепляют воду, как это делают растения, не выделяют кислород и поэтому лишены целого ряда ферментов, занимающихся этим нелегким делом. Вместе с тем принципы преобразования световой энергии в химическую энергию органических соединений у бактерий, водорослей и растений, по-видимому, существенно не различаются. Все это дает надежду на более полное описание механизма действия фотосинтезирующего аппарата прежде всего у бактерий. Логика поиска: от простого к сложному. Попробуем ограничить себя и рассказать в основном о механизме бактериального фотосинтеза.

Аппарат укрощения

Вы, вероятно, заметили, что логичный, в общем-то, для ученых принцип энергообеспечения, о котором мы уже упоминали, может показаться не совсем логичным для непосвященных. В самом деле, стоило ли монтировать громоздкую систему преобразования энергии солнечного счета в энергию химических связей органических соединений? Ведь, как известно, для того чтобы обеспечить себя энергией, живые организмы все равно будут вынуждены расщепить их, извлечь их энергию и направить ее для получения аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) - универсального энергетического донора биохимических реакций. А нельзя ли использовать солнечные кванты непосредственно, внедрить их энергию прямо в биохимические процессы? Увы, нет! И виной тому, прежде всего, мимолетность жизни кванта солнечного света. Он жив, пока светит Солнце. А жизнь клеток не может останавливаться на заходе Солнца и возрождаться вместе с восходом. Энергия нужна клеткам постоянно. Непостоянную энергию солнечного кванта необходимо стабилизировать. Нужен аппарат укрощения его энергии.
И, конечно, он существует. Все процессы преобразования энергии солнечного света происходят в специализированных мембранных структурах - в хлоропластах у растений и в хроматофорах у бактерий - энергопреобразующих органеллах фотосинтезирующих организмов. А начинаются эти процессы, как мы уже знаем, в молекуле особого пигмента - хлорофилла. В хлоропластах и бактериальных хроматофорах содержатся две фракции хлорофилла, различающиеся по своим свойствам. Больше всего хлорофилла (98% или более от его общего количества) занимается светосбором. Это так называемая хлорофильная молекулярная антенна. Название необычное, но весьма точное. Равномерно распределенный в мембране органелл, хлорофилл молекулярной антенны, как это следует из его названия, настроен на прием квантов солнечного света. Попав в молекулу хлорофилла, кванты "заряжают" некоторые электроны хлорофилла своей энергией, которые мгновенно переходят на новый, более высокий энергетический уровень. Такие "возбужденные" электроны, вполне естественно, стремятся избавиться от избытка энергии и перейти в свое прежнее, более устойчивое энергетическое состояние. И вот здесь-то раскрывается другая функция молекулярной антенны: передача энергии молекулам другой, меньшей фракции хлорофилла - молекулам хлорофильных реакционных центров.
Выделение хлорофильных реакционных центров бактерий в чистом виде, проведенное сравнительно недавно, несомненно, одно из крупных достижений в исследовании структуры и функций фотосинтезирующего аппарата. И достигнут этот успех был благодаря использованию поверхностно-активных веществ - детергентов, способных внедряться в толщу белковофосфолипидных мембран энергопреобразующих органелл и извлекать из них хлорофилл-белковые комплексы. Мембраны отдают в раствор свои компоненты, а дальнейшее выделение чистых ферментов - дело биохимической технологии. Биохимическими методами отдельно получены и комплексы реакционных центров, и комплексы светсобирающей антенны. Появилась возможность подробно изучить состав реакционных центров - того самого святилища, в котором совершаются первичные процессы аккумуляции энергии Солнца.
Оказалось, что в состав реакционных центров входит белок, состоящий из трех частей - субъединиц, четыре молекулы бактериохлорофилла, две молекулы другого пигмента - бактериофеофитина, одна-две молекулы специального переносчика зарядов - убихинона и один атом железа. Такой комплекс и преобразует дальше энергию "возбужденных" электронов.
Примерно 50 молекул антенны передают свою энергию на одну молекулу реакционного центра. В этой молекуле как бы фокусируется энергия, полученная от десятков молекул антенны. И результат такого обилия энергии неизбежен: включается реакция разделения зарядов. Бактериохлорофилл отдает свой богатый энергией электрон через бактериофеофитин на первичный акцептор "возбужденных" электронов, которым, по-видимому, является комплекс железа и убихинона. Так разделяются заряды: бактериохлорофилл теряет электрон - заряжается положительно, а первичный акцептор его получает, он приобретает отрицательный заряд. Трудно представить себе времена, за которые происходит эта реакция - примерно 10-10 с.
Но это только начало. Стабилизация энергии еще не произошла. Электрон готов в любое время вернуться в исходное состояние. И, конечно, его энергия была бы потеряна безвозвратно. Так происходит в пробирке с выделенным хлорофиллом, очищенным от других компонентов, которые принимают участие в дальнейшей судьбе "возбужденного" электрона. Хлорофилл в пробирке светится и его флуоресценция не что иное, как самопроизвольное испускание энергии в той форме, в которой она была получена - в виде света.
И чтобы этого не произошло, действует комплекс окислительно-восстановительных ферментов, которых лишен очищенный хлорофилл. В неповрежденных мембранах фотосинтезирующих органелл реакционные центры упакованы в тесном взаимодействии с комплексом окислительно-восстановительных ферментов - фотосинтетической цепью переноса электронов. Это убихинон, цитохромы - белки, содержащие железо, соединенные между собой последовательно, перехватывающие электрон у первичного акцептора и передающие его друг другу. В процессе такой эстафетной передачи богатый энергией электрон также теряет свою энергию, но теперь он это делает постепенно, небольшими порциями, которые, в свою очередь, используются на синтез АТФ. Выжав из электрона избыточную энергию, цитохромы возвращают его на прежнее место в молекулу бактериохлорофилла. Он вновь готов принять очередную порцию энергии.
Очевидно, в этой общей схеме кроется немало различных загадок, но самая важная из них, несомненно, загадка трансформации энергии, которая выделяется при переносе электронов по фотосинтетической цепи, в энергию химических связей АТФ. Именно этот процесс и является основным в деле запасания и стабилизации солнечной энергии. Природа избрала АТФ на роль своеобразной энергетической валюты, которой оплачивается практически любая функция в живом организме, нуждающаяся в энергии. Центральное место АТФ в энергетике клетки определяется тем, что именно на использование ее энергии настроены в ходе эволюции биохимические процессы. И в этом проявляется еще одна из многих мудростей живого - образование унифицированной формы энергии, такой ее формы, которая могла бы быть использована в самых разных процессах.
Уникальные свойства АТФ не являются чем-то мистическим. Способность аккумулировать энергию определяется природой ее химических связей, своеобразием их электронных взаимодействий. В этой молекуле связаны воедино пять компонентов: два из них органического происхождения - аденин и сахар, рибоза и три - неорганического, остатки фосфорной кислоты. При синтезе АТФ, так называемом фосфорилировании, к молекуле аденозиндифосфорной кислоты (АДФ), содержащей два остатка фосфорной кислоты, присоединяется третий остаток. Этот остаток невозможно присоединить, не затратив энергии, которая трансформируется в энергию связи между двумя остатками и "заряжает" электроны, образующие эту связь. Гидролиз АТФ, разрыв ее высокоэнергетической связи сопровождается выделением той энергии, которая была затрачена на ее образование. Если гидролизовать АТФ в пробирке - энергия рассеется в виде тепла. В клетке энергия передается совместно с остатком фосфорной кислоты, который присоединяется к молекуле какого-либо фермента, катализирующего биохитгеческую реакцию, и активирует ее своей энергией.
Сразу заметим, что и на молекуле АТФ стабилизация энергии солнечного света не закончилась. АТФ можно назвать лишь относительно стабильным соединением. Со временем оно самопроизвольно гидролизуется и теряет свою энергию. Как же решается это противоречие? Энергия АТФ направляется на биосинтез глюкозы. И вот адесь-то энергия электронов, возбужденных солнечным цветом, стабилизируется окончательно. Сахар (это мы знаем из повседневной жизни) можно хранить сколько угодно и использовать по мере необходимости. Это и делает живая природа. Постепенно расходуя свои запасы углеводов, она окисляет их и извлекает энергию, заключенную в химических связях. Энергия глюкозы не могла бы быть реализована полностью без участия митохондрий - энергопреобразующих органелл животных и растений. Митохондрии - своеобразные антиподы хлоропластов. Если последние используют АТФ на синтез стабильных органических веществ, то митохондрии, напротив, используют органические вещества, продукты расщепления белков, жиров и углеводов, чтобы получить АТФ. В противоположность фотосинтетическому фосфорилированию, которое происходит при .фотосинтезе, реакция образования АТФ в митохондриях названа окислительным фосфорилированием. В этом определении - сущность процесса, так как синтез АТФ ,в митохондриях происходит сопряженно с окислением органических питательных веществ дыхательной цепью. Длительная цепь, ряд соединенных последовательно окислительно-восстановительных ферментов (цитохромов и других компонентов), захватывает богатые энергией электроны окисляемых веществ, с тем чтобы совсем так, как; в фотосинтетической цепи, постепенно лишить их энергии я направить ее на синтез АТФ. Обедненные энергией электроны соединяются с кислородом в реакции образования воды.
При окислении питательных веществ в митохондрии поребляется кислород, а выделяются углекислый газ и вода, которые используются на фотосинтез глюкозы. Так замыкается круговорот веществ в живой природе, неразрывно связанный с энергетическим циклом.
Таким образом, решение проблемы преобразования солнечной энергии - это, прежде всего, решение вопроса о том, каким образом энергия богатых энергией электронов трансформируется в энергию химических связей АТФ,- основного вопроса биоэнергетики.

Трансформация... трансформаторов

Когда в 1966 г. Владимир Петрович Скулачев, заведующий отделом биоэнергетики, ныне член-корреспондент АН СССР, рассказывал о ситуации, сложившейся к тому времени в области окислительного и фотосинтетического фосфорилирования, он нарисовал странный на первый взгляд график, но который, как оказалось, превосходно ее иллюстрировал. По одной оси им были отложены годы, а по другой... отношение оптимистов в биоэнергетике к пессимистам. Оптимисты упорно верили в возможность ближайшего решения проблемы, пессимисты - нет. Тогда, в 1966 году, график стремительно мчался вниз, отражая собой крайний пессимизм, охвативший большинство исследователей. Казалось, что надежды повернуть упрямую кривую вверх полностью исчерпаны.
Чрезвычайно популярная среди биохимиков в то время "химическая" гипотеза фосфорилирования, сопряженного с переносом электронов, не могла этого сделать. Более того, она постоянно разочаровывала, не в силах справиться с объяснением экспериментальных фактов. Сторонники "химической" схемы энергетического сопряжения полагали, что энергия, выделяющаяся при переносе электронов, переходит в молекулу АТФ при посредничестве промежуточных высокоэнергетических соединений. Решить проблему, по их мнению, означало найти и охарактеризовать эти соединения. Шли годы, а соединения, обозначенные на схеме символами неизвестных, оставались неразгаданными. И мыслимое ли дело поймать какого-либо из этих неизвестных прямо на месте преступления", в момент передачи ими энергии на синтез АТФ, если предварительно постулируется их высокая лабильность? Безнадежное дело! Настоящая охота, которую развернули на "икс" биоэнергетики, окончилась провалом. И хотя поискам сопутствовали часто очень интересные, важные наблюдения, много сил и времени было потрачено впустую. Неудача, к сожалению, не сломила инертность мысля. По аналогии с прежней схемой к объяснению результатов привлекались новые символы. Когда же возникла опасность, что для обозначения неизвестных высокоэнергетических соединений не хватит букв латинского алфавита, традиционно использовавшихся для их обозначения, наступило всеобщее разочарование. На графике этому моменту соответствовал глубокий минимум.
А в это время на юго-западе Англии, в маленькой лаборатории, созданной на собственные средства, колдовал над митохондрией Питер Митчелл. Он не мог двинуть в поход за тайной фосфорилирования утонченную современную технику и тщательно изучал данные, полученные с помощью заурядного рН-метра, прибора, настроенного на измерение концентрации ионов водорода. Этот прибор, далеко не чудо измерительной техники, является неизменным атрибутом любой биохимической лаборатории. Состоялось очередное подтверждение старой истины: техника, сколь совершенной она бы ни была, сама по себе в науке бессильна; оригинальность мысли, умение обратить внимание на факты, мимо которых прошли многие,- вот ее истинный двигатель.
К 1966 г. Митчеллом были опубликованы первые свидетельства в пользу своей гипотезы, о которой он впервые заявил еще в 1961 г. Тогда она прошла практически незамеченной. С одной стороны - привычка оперировать знакомыми схемами, с другой - законная осторожность, вызванная необычайной плодовитостью биоэнергетиков того времени на гипотезы энергетического сопряжения.
В 1966 г. на съезде Федерации европейских биохимических обществ состоялось и первое публичное обсуждение предположений Митчелла в кругу ведущих специалистов... и они были отвергнуты. И кто из самых яростных оппонентов Митчелла мог тогда предположить, что всего лишь через 12 лет автор этих, как их назвали, "фантастических" предположений будет удостоен Нобелевской премии, выдающегося признания его заслуг! Идеи Митчелла отпугивали своей сложностью и новизной подхода, но, надо признать, и значительно привлекали. И прежде всего многообразнейшими возможностями их проверки. В соответствии со взглядами Митчелла фотосинтети ческая цепь переноса электронов в хлоропластах и хроматофорах или дыхательная цепь в митохондриях особым образом перешнуровывает мембрану этих органелл, петляя от одной ее поверхности к другой. Перенос электронов по цепям ферментов, ориентированных таким способом, сопровождается транспортом положительно заряженных ионов водорода-протонов через мембрану, что неизбежно приводит к возникновению разности электрических потенциалов по две ее стороны. Таким образом, цепи переноса электронов в мембранах работают как генераторы электрического тока. Более того, по Митчеллу, каждый отдельный олигоферментный комплекс, входящий в состав электронтранспортной цепи,- генератор электрического тока. Нетрудно заметить, что этот процесс не мог бы реализоваться вне мембраны. Мембрана у Митчелла одно из главных действующих лиц в процессе сопряжения. Очевидно, что она должна выполнять функцию изолятора, разделяющего две группы зарядов: отрицательных, с одной стороны, и положительных - с другой. Для того чтобы удержать возникший мембранный потенциал, необходимо ее высокое электрическое сопротивление. Совсем как в конденсаторе, где малейшее нарушение изоляции приводит к пробою, к разряду электрического тока. Любопытно, но до Митчелла роль мембраны в энергетическом сопряжении практически не учитывалась. То, что эти процессы протекают в мембране, воспринималось скорее как случайность, а не неизбежность. С другой стороны, не придавалось большого значения и высокой упорядоченности мембран, трансформирующих энергию, тому порядку, с которым уложены в мембране молекулы ферментов и фосфолипидов.
Указания на то, что комплексы ферментов, преобразующих энергию, располагаются в мембране не беспорядочно, были получены и раньше. К примеру, было ясно, что молекулы хлорофилла в хлоропластах расположены в особых упорядоченных структурах, гранах, которые соединяются между собой и образуют своеобразные стопки, наподобие пластинок в электрической батарее. В этом исследователи видели, и вполне справедливо, одну из причин высокой эффективности фотосинтеза, закономерного и последовательного характера его процессов.
Необходимость упорядоченной структуры сопрягающих мембран - тех, в которых локализованы трансформаторы энергии, становится еще более очевидной с точки зрения Митчелла. Образование мембранного потенциала оказалось бы невозможным без особой организации ферментов цепей переноса электронов внутри мембраны, которая бы обеспечила векторный транспорт электрических зарядов через мембрану. И как следствие этого - асимметричность мембраны, ее анизотропия. Отсюда становится ясным, почему отдельные составные компоненты полиферментных комплексов, к каким относятся и цепи переноса электронов, должны располагаться на одной поверхности мембраны, а другие - на другой. Очевидно, что только в этом случае произойдет разделение зарядов в масштабе мембраны при протекании окислительно-восстановительной реакции между двумя отдельными ферментами. Образование разности электрических потенциалов на мембране и определяет, по Митчеллу, все последующие события: синтез АТФ, транспорт ионов и многое, многое другое. Особенно легко решаются теперь проблемы транспорта веществ через мембрану, долгое время не поддававшиеся разрешению. Действительно, если есть электрическое поле на мембране, значит, есть и сила, способная привести в движение заряженные вещества - ионы. По принципу обычного электрофореза положительно заряженные ионы пойдут в область, заряженную отрицательно, а отрицательные - в противоположном направлении. Помимо трансмембранной разности электрических потенциалов, которая является следствием разделения электрических зарядов, при работе цепей переноса электронов, таким образом, должен возникать также и градиент ионов водорода, транспортируемых через мембрану. Ну,а если есть градиент ионов водорода, значит, имеется возможность переправить через мембрану и нейтральные молекулы, способные использовать энергию этого градиента.
А как же с АТФ? Каким образом можно решить проблему ее синтеза, если мембранный потенциал действительно существует? Митчелл считает, что именно энергия электрического потенциала является движущей силой ее синтеза. Достигнув определенной величины при работе цепей переноса электронов, электричество включает работу АТФсинтетазы, фермента, встроенного в ту же мембрану и настроенного на синтез АТФ из АДФ (аденозиндифосфорной кислоты) и неорганического фосфата.
Так становится очевидным, что постулируется существование промежуточного этапа преобразования энергии солнечного света или питательных веществ: энергия, каково бы ни было ее происхождение, сначала обязательно превращается в электрическую, а затем трансформируется в химическую, в энергию АТФ.
Нетрудно заметить, что неуловимый высокоэнергетический интермедиат электронтранспортного фосфорилирования, предмет давнего вожделения сторонников "химической" схемы, приобретает зримые очертания. Это не что иное, как то самое электричество, которое уже давно используется человеком в качестве посредника при любых превращениях энергии. И кто бы мог подумать, что в живой клетке унифицированная форма энергии тоже электрическая?
А почему бы и нет? Электрическая энергия, это мы хорошо знаем, обладает массой различных достоинств. Ее легко, при наличии, конечно, соответствующих трансформаторов, можно превратить в другие виды энергии - в тепловую, световую, химическую. Ее просто передавать на далекие расстояния. И почему бы клетке не воспользоваться этими достоинствами? И она, как это ясно теперь, не упустила эти возможности. Мимо достоинств электричества не прошел и Митчелл при обдумывании своей, как он назвал, "хемиосмотической" гипотезы энергетического сопряжения. За прошедшие годы гипотеза трансформировалась в теорию. Столь же существенную трансформацию претерпели за эти годы и наши представления о трансформаторах энергии в живой клетке. И вот как это произошло...

В поисках мембранного электричества

Даже при поверхностном знакомстве с идеями Митчелла ясными становятся шаги, которые можно было бы предпринять для их проверки. И, разумеется, прежде всего необходимо ответить, действительно ли энергия, выделяющаяся при переносе электронов, преобразуется в электрическую. Это не только центральный постулат Митчелла - доказательство существования электрического потенциала на мембранах энергопреобразующих органелл перевернуло бы наши представления о путях трансформации солнечной энергии и энергии питательных веществ в живых клетках, сдвинуло бы с мертвой точки решение проблемы о движущей силе ионов и продуктов обмена веществ через мембрану, что само по себе имеет немаловажное значение.
Но как это сделать? Обнаружение разности электрических потенциалов на биологических мембранах не является тривиальным делом. Немало трудностей преодолели исследователи, чтобы научиться измерять электрические сигналы при проведении возбуждения по нервному волокну с помощью микроэлектродов. Используя опыт такого рода измерений, микроэлектродную технику применили американские исследователи Тапер и Тедески для определения мембранного потенциала митохондрий - и потерпели неудачу. Потенциал, зарегистрированный ими, оказался равным лишь 20 мВ и был ориентирован в направлении, противоположном тому, которое предсказывал Митчелл. Приверженцы "химической" схемы торжествовали: гипотеза не оправдывалась в самом главном пункте. И, как ни парадоксально, с некоторым чувством удовлетворения восприняли эти результаты и сторонники английского ученого. Они предсказывали неудачу прямого микроэлектродного метода.
В самом деле, митохондрия - крошечное образование, ее диаметр редко превышает 3 мк. Не так-то просто ввести в митохондрию электрод, чей диаметр лишь в несколько раз меньше ее собственного. А если к тому же мембрана обладает свойствами, которыми ее наделил Митчелл, то введение электрода нанесло бы ей тяжелую травму: нарушение ее изоляционного слоя и как следствие утечка электрического заряда. Вот почему неудача микроэлектродного метода была воспринята скорее как подтверждение, а не как опровержение хемиосмотической гипотезы.
Большего успеха достигли исследователи на биологическом факультете МГУ под руководством Ф. Ф. Литвина и Г. А. Куреллы. В качестве объекта для микроэлектродного измерения мембранного потенциала ими были использованы относительно крупные хлоропласты, выделенные из специальных видов растений и обладающие диаметром до 25 мк. Введение электрода в такой хлоропласт оказалось менее "болезненным" для него, и он был способен проявлять исходные свойства. Так, было показано, что при освещении хлоропластов происходит быстрое образование разности электрических потенциалов на мембране. Одновременно стало очевидным, что возможности использования микроэлектродов в опытах с хроматофорами бактерий практически сводятся к нулю: средний диаметр хроматофоров равен 400-600 А - в десять раз меньше митохондриального.
В связи с непригодностью микроэлектродного метода пришлось сосредоточить усилия на исследовании процессов, хотя бы косвенно указывавших на образование мембранного потенциала. Это вполне возможно, если научиться следить за перемещением заряженных частиц в среде, где работают органеллы, выделенные из клетки. Логика ясна: если внутрь частиц пойдут положительно заряженные ионы, значит, внутри - минус, если отрицательные - плюс. И наоборот.
Именно такие эксперименты, поставленные Митчеллом, и дали первые свидетельства образования мембранного потенциала в митохондриях. Лабораторный рН-метр помог ему зарегистрировать появление в среде ионов водорода при работе дыхательной цепи.
Более корректный метод был разработан в нашей стране под руководством Е. А. Либермана и В. П. Скулачева. Электрическая схема митохондрий, хлоропластов и хроматофоров исследовалась с помощью синтетических ионов, различающихся по своей природе и знаку заряда, но сходных в одном: все они легко проникали через фосфолипидные мембраны. Это весьма важное свойство, которое позволяло им быть чуткими индикаторами изменений электрического поля на мембране.
В опытах с синтетическими ионами были получены изящные подтверждения основных положений гипотезы. При добавлении в среду инкубации митохондрий питательных веществ отрицательно заряженные ионы тотчас же выходили из частиц, что могло быть объяснено только давлением на них электрического поля со знаком "минус" на внутренней стороне мембраны. В хроматофорах ориентация потенциала оказалась обратной. При их освещении "минусы" входили в частицы, притягиваясь к внутреннему "плюсу". Так казавшееся вначале фантастическим предположение Митчелла обретало реальные очертания: перенос Электронов по цепям окислительно-восстановительных ферментов действительно сопровождался генерацией электрического тока в мембране. Энергопреобразующие органеллы, которые прежде называли электростанциями живой клетки лишь ради красного словца, желая подчеркнуть их исключительную роль в процессах энергообеспечения, ими оказались и на деле.
Как сказал однажды В. П. Скулачев, результат работы был приятен еще и потому, что затевалась она с целью опровергнуть идеи Митчелла, а не подтвердить. Ведь обилие гипотез, в одинаковой степени интересных, имеет и отрицательную сторону: отвлекает внимание и рассеивает силы. Путь к истине может стать короче, если решительно отвергнуть идеи, на первый взгляд привлекательные, но не выдерживающие многосторонней проверки. Так будет отточено острие поиска.
Гипотеза Митчелла крайне заманчива для опровержения - стоит только показать, что мембранного потенциала не существует, и ее изящное здание рухнет, как карточный, домик. Но этого не случилось и не могло случиться. На этот раз ученые решились опровергнуть реально существующее явление, а в результате доказали его. Так и должно быть, если позиция экспериментатора объективна и беспристрастна.
И все же, несмотря на довольно убедительные свидетельства существования на мембранах, преобразующих энергию, разности электрических потенциалов, недоверие к хемиосмотической гипотезе оставалось. Опыты с ионами, носили косвенный характер, а в силу чрезвычайной важности проблемы требовались прямые доказательства. И они были получены...

Проблемы и протеолипосомы

Мы уже почти привыкли к тому, что решение фундаментальных загадок природы не проходит без ломки многих привычных представлений, которые складывались десятилетиями. Так было в физике и химии, так на наших глазах происходит в биологии. К фундаментальным относится и тайна энергетического сопряжения, и гипотеза Митчелла - не исключение, а яркое подтверждение этого правила.
И еще одно заключение, которое ставит хемиосмотическую гипотезу в ряд с наиболее выдающимися,- ценность ее следствий. Как из любой плодотворной гипотезы, из гипотезы Митчелла вытекают следствия, имеющие не менее важное значение, чем ее основные постулаты. Следствия, способные к самостоятельной жизни.
К ним относится и предположение о существовании белковых генераторов электричества. Нетрудно видеть, что мысль об этом скрывается в главном митчелловом постулате - о мембранном потенциале. В самом деле, образование мембранного потенциала, если таковой существует, невозможно без участия белков ферментов, катализирующих перенос зарядов через мембрану, а значит, в живых клетках должны существовать белковые электростанции. Задача - найти их и доказать их функцию. И это много больше, чем простое подтверждение одного из предположений Митчелла,- это открытие особого класса белков, специальность которых - трансформировать химическую или световую энергию в электрическую форму. Игра стоит свеч!
Итак, определив цель исследований, неплохо бы определить и их предмет, представить, каковы же претенденты на эту роль? Ну, это уже не столь сложно. По-видимому, прежде всего, белковыми электростанциями должны быть любые из полиферментных комплексов, входящих в состав цепей переноса электронов и способных работать в автономном режиме. Цепь переноса электронов - не что иное, как электрическая батарея, элементы которой- отдельные полиферментные комплексы. А если так, то любой из элементов может быть отделен от других без потери электрогенных свойств. Да, но при этом нельзя забывать, что электрический потенциал, который образуют электронпереносящие цепи, - трансмембранный, а поэтому электрогенные свойства ферментов не могут реализоваться вне мембраны. Игнорирование мембран в энергетическом сопряжении, по-видимому, и было причиной неудачных попыток продемонстрировать синтез АТФ при работе изолированных ферментов дыхательной цепи митохондрий в растворе.
Стало очевидным: изолированный и очищенный от других компонентов мембранный белок необходимо вновь включить в мембрану. А далее все просто: если фермент - "один в поле воин", то включение реакции, которую он катализирует, приведет к генерации электрического потенциала. Да, но как это сделать? Ведь, по существу, придется каким-то образом повторить путь, пройденный природой, и собрать действующую мембрану из составляющих ее компонентов. Не будет ли этот путь слишком длинным? И можно ли избежать неминуемых на таком пути подводных камней? Как оказалось впоследствии, эти трудности преодолеть можно.
...Принцип метода, разработанного в лаборатории Э. Рэкера в США, прост и остроумен. Он позволил реконструировать исходную функцию изолированных ферментов дыхательной цепи митохондрий при их включении в искусственную мембранную систему. Для этого вначале из мембран митохондрий извлекался фермент, катализирующий какую-либо одну реакцию. Затем выделялись фосфолипиды, составляющие каркас мембраны, которые разбивались на мельчайшие частицы с помощью ультразвука и детергента. Полученные растворы фосфолипидов и фермента смешивали, а смесь помещали в мешочек из целлофана. Поры в целлофане были настолько малы, что не пропускали ни молекул фосфолипидов, ни молекул фермента. Если такой мешочек поместить в сосуд с раствором, то. в окружающий раствор уйдут только молекулы детергента, а фоефолипиды и белки останутся.
И вот оказалось, что при медленном удалении детергента фоефолипиды и белки самопроизвольно соединяются друг с другом, образуя миниатюрные мембранные пузырьки - протеолипосомы, способные катализировать соответствующие биохимические реакции. Добавив к раствору фосфолипидов фермент, замыкающий дыхательную цепь,- цитохромоксидазу и АТФсинтетазу из тех же митохондрий, в лаборатории Рэкера получили протеолипосомы, мембраны которых содержали и цитохромоксидазу и АТФсинтетазу. Такие протеолипосомы синтезировали АТФ при работе цитохромоксидазы.
Максимальное упрощение аппарата сопряжения, которое было достигнуто в этом опыте, позволило получить информацию о его работе, недоступную в случае целой, илцфкак говорят биохимики, интактной, митохондрии. Все бы хорошо, но о мембранном потенциале вновь получены лишь косвенные данные.
Использовав метод проникающих ионов, образование мембранного потенциала в таких протеолипосомах зарегистрировали в лаборатории В. П. Скулачева. Это был серьезный шаг вперед, который дал надежду на использование протеолипосом при изучении белковых преобразователей энергии. Итак, модель найдена, и довольно удачная, но метод измерения потенциала по-прежнему неудовлетворителен. На повестке дня - старая, нерешенная проблема, проблема прямых вольтметрических измерений мембранного электричества, так как только они могут дать неопровержимые доказательства причастности белков к "электрическому делу".
И, кажется, ясна основополагающая идея такого рода измерений: создание мембранной системы, которая включала бы в себя белковые комплексы и к которой можно было бы подобраться с помощью макроэлектродов. Неудачи с микроэлектродами слишком памятны. Белки необходимо включить в плоскую фосфолипидную мембрану. Электрические характеристики такой мембраны можно измерить макроэлектродами, расположенными по разные ее стороны.
Ну что же? Техника создания искусственных фосфолипидных мембран на небольших отверстиях в тефлоновых пластинках уже отработана. Плоская мембранка закрывает отверстие всякий раз, когда к нему подносят каплю фосфолипидов, растворенных в органике. Если тефлоновая пластинка с такой мембраной разделяет сосуд с электролитом на два отсека и в эти отсеки опускается по электроду, то готова система, с помощью которой можно исследовать электрические свойства искусственной мембраны. Проблема заключается в том, чтобы инкрустировать мембрану белком и при этом сохранить его исходные свойства.
И вот здесь скрывался корень зла. Несмотря на общую ясность подхода, решение ускользало. Белки не желали работать в такой системе. Более 20 лет пытался встроить белки в плоскую мембрану мексиканский ученый Монтал, многие годы безуспешно проработал в том же направлении американский исследователь Тиен. Неудачи следовали за неудачами. Чувствовалось, что упускается что-то крайне важное, что-то, без чего решение невозможно. Чувствовалось, не хватает оригинальной свежей идеи.

Белковые генераторы электричества

...Надежда на успех пришла неожиданно. В 1973 г. все с интересом слушали об удивительном открытии американца В. Стокениуса, с которым В. П. Скулачев познакомился в США на одной из конференций по биоэнергетике. В. Стокениус описал необычный белок из мембран фиолетовых бактерий, обитающих в просоленных, неуютных Калифорнийских пустынь. Названный бактеином, этот белок был очень красив. Почти пурпурный определял окраску не только бактерий, но и озер, давших им приют. Он относительно прост по строению и тем не менее загадочен, поскольку ретиналь, входящий в его состав, придает ему сходство со зрительным тарентом наших глаз - родопсином, ответственным за восприятие световых сигналов.
Этот белок - находка, тем более странная, поскольку система, необходимая для дальнейшего преобразования солнечной энергии у фиолетовых бактерий, начисто отсутствует. Это тем более странно, поскольку энергетика этих бактерий вполне обеспечена за счет дыхания. Что за бессмыслица - поглощать свет и не уметь его использовать? А ведь в природе, кажется, все целесообразно. А что, если этот белок необходим в каких-либо экстремальных условиях, например, в условиях кислородного голодания? Ведь в этом случае энергия солнечного света оказалась бы весьма кстати. Эта мысль и побудила Стокениуса заняться бактериородопсином со всей серьезностью.
Первая важная информация о функции бактериородопсина была получена с помощью все того же лабораторного рН-метра, так прекрасно зарекомендовавшего себя. На глазах у Стокениуса рН-метр зарегистрировал таинственные колебания концентрации ионов водорода в среде инкубации фиолетовых бактерий: при освещении клеток количество ионов водорода в среде увеличивалось, а л темноте уменьшалось. Увеличение концентрации ионов водорода в среде могло произойти лишь в результате фотохимической активности бактериородопсина, переносящего протоны через мембрану под действием света. А раз это так, то бактериородопсин - не что иное, как еще один трансформатор солнечной энергии.
С этих позиций становится понятным смысл корреляции баоевнтеза этого белка у бактерий с периодом их интенсивного накопления. Рост биомассы и как следствие быстрое истощение кислорода в среде обитания включает биосинтетические реакции, конечный продукт которых - бактериородопсин. Энергетика бактериальных клеток перестраивается: они становятся фотосинтезирующими и вместо химической энергии питательных веществ начинают использовать солнечную энергию.
Участие бактериородопсина в энергетическом сопряжении изящно продемонстрировали Рэкер и Стокениус. В одних протеолипосомах они объединили, кажется, несовместимое: бактериородопсин бактерий, АТФсинтетазу митохондрий и фосфолнпиды растений. И тем не менее образовался дружный ансамбль, способный синтезировать АТФ при включении света. С точки зрения сторонников "химического сопряжения", комбинация немыслимая, но вполне возможная с точки зрения сторонников хемиосмотических представлений, согласно которым синтез АТФ запускается электричеством, каково бы ни было его происхождение. Это и подтвердилось в эксперименте. Так что же: бактериородопсин - еще один белковый генератор электрического тока?
Да! И это утверждение было сделано в лаборатории В. П. Скулачева. Через мембраны протеолипосом, содержащих в качестве белкового компонента бактериородопсин, при включении света транспортировались синтетические ионы, что указывало на образование разности электрических потенциалов. Решающий же аргумент был получен тогда, когда бактериородопсиновые протеолипосомы удалось присоединить к плоской фосфолипидной мембране, разделяющей два отсека с погруженными в них макроэлектродами.
Решение проблемы прямых вольтметрических измерений мембранного электричества оказалось неожиданно простым: плоская мембрана инкрустировалась белком протеолипосом, которые связывались с ней с помощью кальция или других катионов. Включение света - и перо самописца, соединенного с вольтметром, рисует кривую генерации разности электрических потенциалов на плоской мембране. Очередной щелчок выключателя - и потенциал, рассеиваясь, исчезает. Сомнений нет, бактериородопсин работает как генератор электрического тока.
Высокая стабильность бактериородопсина (он не теряет своей активности при нагревании до 100° и хранится в холодильнике месяцами - вот уж действительно "не боится ни жары и ни холода") давала надежду на его прямое встраивание в плоскую фосфолипидную мембрану без помощи протеолипосом. С ним можно манипулировать как угодно долго. И еще одно удобство работы с этим замечательным белком - свет в качестве источника энергии.
В самом деле, плоская искусственная мембрана - создание нежное и боится малейших колебаний окружающей среды. Добавление в среду веществ превращается в целую проблему. Мембрана безжалостно рвется, зачеркивая тем самым усилия многих часов работы. Свет - совсем другое дело. С ним можно экспериментировать без особого риска.
Совокупность всех этих достоинств и позволила Л. А. Драчеву и его сотрудникам в лаборатории В. П. Скулачева в относительно короткое время подобрать условия, при которых бактериородопсин непосредственно вкраивался в плоскую мембрану и работал как светозависимый генератор электрического тока.
Используя опыт работы с бактериородопсином, нам удалось разработать универсальный метод прямого измерения электрической активности индивидуальных ферментов, участвующих в трансформации энергии. Схема любого из таких экспериментов воспроизводит всю эволюцию войска метода и включает в себя выделение и очистку мембранных белков, которые подозреваются в "электрическом деле", создание протеолипосом для реконструкции их свойств и встраивание последних в искусственную фосфолипидную мембрану.
Так удалось показать, что кроме бактериородопсина молекулярными генераторами электричества являются цитохромоксидаза и трансгидрогеназа митохондрий. Генератором оказалась и АТФсинтетаза, если ее заставить работать в обратном режиме, не на синтез, а на гидролиз АТФ. Разлагая АТФ, АТФсинтетаза меняет направление трансформации энергии и преобразует химическую энергию АТФ в электрическую форму. Вместе с изменением направления реакции фермент меняет и свое название: теперь он становится АТФазой.
Необходимо отметить, что открытие функции бактериородопсина ознаменовало собой крушение одной, казалось бы, наиболее незыблемой догмы биологии. Догмы, в которой утверждалось уникальное место хлорофилла в процессах фотосинтеза. Теперь ясно, хлорофилл может быть заменен другим пигментом, способным трансформировать солнечную энергию в электрическую.
Доказательство того, что при фотосинтезе солнечный свет используется в первую очередь для образования разности электрических потенциалов на мембранах фотосннтетиков, было получено нами в опытах с реакционными центрами из хроматофоров фотосинтезирующих бактерий, которые, как вы помните, сопрягают процессы поглощения света и миграции энергии электронного возбуждения с переносом электронов по цепи окислительно-восстановительных ферментов.
Основываясь на опыте реконструкции митохондриальных систем, генерирующих мембранный потенциал, мы разработали метод сборки протеолипосом, содержащих изолированные комплексы реакционных центров. Такие протеолипосомы оказались красивыми не только внешне, по цвету напоминавшими расплавленный топаз. Красивыми оказались и их электрические ответы. Образование электрического потенциала мы регистрировали прямым методом, с помощью плоской мембраны, с которой протеолипосомы легко взаимодействовали в присутствии катионов. Мембранный потенциал возникал всякий раз, когда на плоскую мембрану, инкрустированную протеолипосомами, направлялся луч света.
Сомнений не было: комплексы хлорофильных реакционных центров - молекулярные генераторы электрического тока.
Величина потенциала резко возрастала, когда к протеолипосомам добавляли некоторое количество убихинона, который входит в комплекс первичного акцептора возбужденных светом электронов, и уменьшалась при добавлении ядов, выводящих из строя переносчики электронов или нарушающих изолирующие свойства мембраны. Система "протеолипосомы - плоская мембрана" оказалась отличной моделью для исследования интимных механизмов трансформации энергии. Максимальные электрические эффекты достигались в присутствии убихинона и одного из компонентов фотосинтетической цепи переноса электронов - цитохрома Ц, что свидетельствовало о полной реконструкции аппарата генерации мембранного потенциала в такой системе.
Удовлетворение было бы полным, если бы стали понятны причины странной ориентации электрического поля на мембране протеолипосом: она оказалась противоположной той, которая была отмечена ранее на мембране интактных хроматофоров. Внутренняя сторона мембраны протеолипосом заряжалась отрицательно, и это означало, что протоны, заряжающие мембрану, выделяются в окружающий раствор, а не во внутренний объем.
Закономерный вопрос: не потеряли ли мы при очистке препарата реакционных центров какой-то фактор, ответственный за их ориентацию в мембране? Метод реконструкции позволил ответить и на это. Вместо упрощения рукции бактериального "электрогенератора", к которому мы "стремились вначале, желая найти элементарную единицу, способную к генерации фототока, мы приступили к его постепенному усложнению. Для этого к комплексам реакционных центров при реконструкции протеолипосом мы добавляли возрастающие количества комплексов молекулярной антенны, выделенных из хроматофоров. Тех самых, которые собирают кванты солнечного света и поставляют их реакционным центрам. Это было удивительное зрелище, когда при определенном соотношении количества реакционных центров и антенны электрический ответ протеолипосом перевернулся и стал по своему направлению идентичным хроматофорному. Это было тем более удивительно, поскольку сами комплексы молекулярной антенны, реконструированные отдельно от реакционных центров, не обладали никакой фотоэлектрической активностью. Они только поглощали свет, но были неспособны его использовать.
Так стало очевидным, что ориентация электрического поля на мембране зависит от ориентации комплексов реакционных центров в ее толще. В свою очередь, реакционные центры ориентируются в мембране в зависимости от уровня структурной организации пигмент-белковых комплексов, которые используются при реконструкции. Такую организацию могут обеспечить лишь комплексы центров и антенны, взятые вместе и в определенной пропорции. Комплексы молекулярной антенны - вот тот таинственный фактор, который ориентирует реакционные центры при образовании мембран и заставляет их согласованно в одном направлении, что, без обязательно для генерации потенциала. Очевидно, что совмещение столь важных функций в одном белковом комплексе антенны имеет особый смысл: один комплекс ответствен и за восприятие солнечной энергии и за ее эффективное использование.
Как показали последующие эксперименты, белковыми генераторами электрического тока являются и компоненты системы преобразования энергии "возбужденных" электронов в хлоропластах растений. Протеолипосомы, нашпигованные зеленым хлорофиллом, выделенным из протертых листьев гороха М. Ильиной, при освещении давали фототок точно так же, как это происходило и в случае использования бактериального хлорофилла. Теперь совершенно ясно: весь смысл первичных преобразований солнечной энергии заключается в генерации электрического потенциала, энергия которого и используется впоследствии клеткой для решения своих энергетических проблем.

Заключение, которое может оказаться прологом

Итак, "ненаучная фантастика" о существовании молекулярных белковых генераторов электрического тока в живых клетках стала научной реальностью. Однако утверждение основных принципов хемиосмотической теории энергетического сопряжения не сняло с повестки дня вопрос о выяснении молекулярных механизмов трансформации энергии. Этот вопрос стал еще более актуальным, так как наметились реальные перспективы для его решения.
С новых позиций ведется сейчас конкретизация механизмов действия каждого отдельного преобразователя энергии. По словам В. П. Скулачева, именно в этом заключается в настоящее время задача биоэнергетической науки. Задача непростая. И, учитывая это, будущее, по-видимому, будет принадлежать исследователям, объединенным вместе для решения общей проблемы. Примеры такого плодотворного сотрудничества уже есть. В рамках организованного под руководством академика Ю. А. Овчинникова проекта "Родопсин" успешно выясняются детали устройства мощного генератора электрического тока, каким является бактериородопсин.
Важнейший прикладной аспект проблемы - применение полученных знаний для создания новых видов фотоэлектрических и топливных элементов, способных трансформировать энергию с высокой эффективностью. Недавние исследования, проведенные под руководством В. П. Скулачева в группе Л. А. Драчева, продемонстрировали возможности создания электрических элементов на основе белковых генераторов электрического тока. Было показано, что прекрасным генератором электричества является мембранный фильтр, пропитанный фосфолипидами и инкрустированный бактериородопсиновыми протеолипосомами или протеолипосомами, содержащими хлорофильные реакционные центры. Стабильность такой системы неизмеримо выше по сравнению с плоской мембраной, а надежность почти стопроцентная. В такой системе работают и другие трансформаторы энергии. Нет сомнений, что фильтры с белками-генераторами, включенными последовательно, могут составить прекрасную электрическую батарею. И это быстро поняли в самых различных лабораториях мира, если судить по количеству публикаций, в которых были воспроизведены полученные у нас результаты.
Исследования в области "модельной биоэнергетики" развернулись сейчас необычайно широко. Используя методы и идеи, предложенные в лаборатории В. П. Скулачева, бактериородопсиновую батарею собрал в Калифорнийском университете Л. Пэкер. Электрическая лампочка, подключенная к такой батарее, горела 90 минут при однократном использовании системы. Батарея сохраняла свои свойства в течение шести месяцев. Прогнозы на создание "белковых электростанций", преобразующих солнечную энергию, довольно оптимистичны. Здесь есть над чем подумать не только биоэнергетикам, но и инженерам. Вот почему наше заключение нам хочется назвать прологом...

Литература